HPLC常见故障排除完美版（1）

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HPLC常见故障排除完美版（1）

注意：

在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

色谱柱的维护

1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）

2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围

3．避免流动相组成及极性的剧烈变化

4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理

5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中

6．压力升高是需要更换预柱的信号

HPLC六通阀进样器的使用及保养

      六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。

     工作原理：

     1、手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；

     2、将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。

     虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。

     以下浅谈有关六通阀进样器的使用及保养事宜(仅供参考)：

     1、手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。

     2、六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75％，如20gL的定量环最多进样15p,L的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20gL的定量环最少进样60至1001aL的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。

     3、可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10gL的定量环，实际是9gL还是1lgL并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。

4、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0．45~tm的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。  

液相色谱仪色谱柱使用及维护

  　　每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！

     　　新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。

     卡套柱的安装（不加预柱） 1．将卡套架套入柱芯

     2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图）

     3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片

     4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧

     5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端

     6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手

     注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。

     卡套柱的安装（加预柱）

     1．将卡套架套入柱芯

     2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图）

     3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片

     4．将"子弹头"预柱放入卡套片内

     5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧

     6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端

     7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手

     更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱）

     注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。

     1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端

     2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧

     3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网

     4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料

     5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平

     6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端

     7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入

     8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平

     平衡色谱柱 　反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。

     　　硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡

     如何平衡色谱柱？

     　　平衡过程中，将流速缓慢地提高

     　　用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）

        色谱柱的再生 　　进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。

     表1　建议用来冲洗的溶剂体积

     色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积

     125-4 1.6ml 30ml

     250-4 3.2ml 60ml

     250-10 -20ml 400ml

     请根据下表选择您的再生方法：

     极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：

     正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**

     非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：

     水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水

     0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱

     注意：

     在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

     **如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

     色谱柱的维护

     1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）

     2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围

     3．避免流动相组成及极性的剧烈变化

     4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理

     5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中

     6．压力升高是需要更换预柱的信号

液相色谱仪(hplc)的保养

      1．HPLC的日常操作条件： 温度：10—30℃；相对湿度<80％； 最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。

     2．泵的保养：

     1)使用流动相尽量要清洁；

     2)进液处的沙芯过滤头要经常清洗；

     3)流动相交换时要防止沉淀；

     4)避免泵内堵塞或有气泡;

     3．进样器的保养：

     1)每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；

     4．柱的保养：

     1)柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；

     2)当柱子和色谱仪联结时， 阀件或管路一定要清洗干净；

     3)要注意流动相的脱气；

     4)避免使用高粘度的溶剂作为流动相；

     5)进样样品要提纯；

     6)严格控制进样量；

     7)每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；

     8)每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；

     9)若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；

     5．检测器(UV)的保养：

     1)紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。

     2)样品池要保养。

高效液相色谱仪的几个使用问题

      1. 色谱柱中的流动相会排干吗？

     不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。

     2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？

     如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。

     使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。

     使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。

     3. 如何预防液相泵的故障:

     要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施:

     1).用高质量试剂和HPLC级溶剂；

     2）、过滤流动相和溶剂；

     3）、脱气；

     4）、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；

     5）、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；

     6）、定期更换垫圈；

     7）、需要时加润滑油；

     8）、查阅有关泵操作手册中的其它建议。

秘诀1：由强到弱： 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试 验， 这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。

秘诀2 三倍规则 ：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。

秘诀3 粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

檢量線的種類有哪些?

通常校正之檢量線大概可以分為兩大類: 線性(linear)與非線性(nonlinear). 線性校正檢量線為直線通過原點(0,0)的零次校正,和不通過原點的一次校正. 而非線性校正則為二次校正或更高次的校正. 今天的重點則是放在最常使用的線性校正上.線性校正在實際的使用時,最常見的就是"線性回歸校正法"(linear regression), 感應因子法(內標法)及校正因子(外標法)等三種.